Текст первой лекции из двух, подготовленной для чтения в НГУ в курсе «Регуляторные геномные последовательности».
(читала Е.В.Игнатьева 16 сентября 2003г.)
Лекция 1: Механизмы регуляции транскрипции
Экспрессия генов - последовательность реакций на пути от гена к белку = процесс передачи информации от ДНК к белку. У эукариотических организмов она включает следующие этапы:
Транскрипция - синтез РНК. Образуется незрелая РНК, содержащая участки, соответствующие экзонам и интронам
Процессинг - вырезание участков, соответствующих интронам,
Сплайсинг сшивание участков РНК, транскрибируемых с эзонов в результате чего образуется матричная РНК
Трансляция синтез белка в цитоплазме клетки при участии рибосом
Ген - протяженный участок ДНК, включает участки, соответствующие экзонам и интронам, старт транскрипции, сайт терминации транскрипции и регуляторные районы.
Регуляторные районы могут быть локализованы в 5’ фланкирующей области, 3‘ фланкирующей области, экзонах и интронах.
Регуляция экспрессии генов может осуществляться на всех этапах. Транскрипция - первый этап, на котором осуществляется выбор, будет ген экспрессироваться или нет.
Рассмотрим три вопроса
как осуществляется транскрипция
чем определяется старт транскрипции
какие механизмы в клетке регулируют интенсивность транскпции
ДНК и РНК – полимеры, состоящие из нуклеотидов. Нуклеотид включает фосфат, азотистое основание и углевод (сахар)
Таблица 1. Нуклеотиды, входящие в состав ДНК и их состав.
Основание |
Нуклеозид = азотистое основание + углевод |
Нуклеотид = нуклеозид +фосфат |
Аденин (А) |
Аденозин |
Адениловая кислота |
Гуанин (G) |
Гуанозин |
Гуаниловая кислота |
Цитозин (C) |
Цитидин |
Цитидиловая кислота |
Тимин (T) |
Тимидин |
Тимидиловая кислота |
Урацил (U) (в РНК вместо Тимина) |
Уридин |
Уридиловая кислота |
. В молекуле ДНК нуклеотиды включают углевод(сахар) - дезоксирибозу, а в молекуле РНК нуклеотид включает углевод(сахар) - рибозу.
Нуклеотиды в ДНК и РНК соединены фосфодиэфирными связями , которые соединяют 3’ углеродный атом одного нуклеотида с 5’ фосфатной группой следующего нуклеотида. Таким образом каждая цепь в ДНК или РНК имеет полярность, которая обозначается как 5’ и 3’ конец.
Молекула ДНК состоит из двух комплиментарных и антипараллельных друг другу полинуклеотидных нитей.
РНК – включает одну полинуклеотидную цепь
Транскрипция – синтез молекулы РНК, комплиментарной и антипараллельной одной из цепи ДНК (матричной цепи)
Соответственно, эта цепь ДНК по которой строится комплиментарная цепь РНК называется матричной цепью. Другая цепь ДНК называется кодирующей цепью, поскольку ее последовательность идентична последовательности РНК. При этом необходимо помнить, что вместо основания Т (тимин) в РНК включается основание U (урацил)
Пример:
ДНК
|
Нематричная (кодирующая) цепь |
TACGGATA |
Матричная цепь |
ATGCCTAT |
РНК, которая синтезируется на основе этого участка:
UACGGAUA |
Видно, что РНК комплиментарна матричной цепи ДНК и идентична кодирующей цепи ДНК
Транскрипция осуществляется при участии фермента – РНК полимеразы.
РНК-полимераза в ходе транскрипции выполняет следующие функции :
- расплетание и заплетание ДНК
- синтез РНК
- движение вдоль цепи ДНК
На слайде РНК-полимераза изображена схематически в виде цилиндра.
РНК-полимераза содержит специальные каналы внутри соответствующие по толщине нитям ДНК и РНК
Шириной 12-15 ангстрем глубиной 20 А
шириной 25 ангстрем глубиной 5-10 А
Скорость синтеза 40 нуклеотидов в секунду при 37 градусах
Механизим транскрипции имеет свои особенности у разных организмов. Мы будем рассматривать два надцарства:
Прокариоты – организмы, клетки которых не имеют ограниченного мембраной ядра. Это все бактерии, включая архе и цианобактерии. Аналог ядра – структура, состоящая из ДНК, белков и РНК (генофор) закреплен на мембране клеток.
Представитель E.Coli – кишечная палочка.
Эукариоты - организмы, клетки которых содержат оформленные ядра. Примеры – высшие животные и растения, одноклеточные и многоклеточные водоросли, грибы.
Этапы транскрипции на примере прокариотического организма (клетка не имеет ядра). Представитель -E.coli кишечная палочка.
Первый этап транскрипции - распознавание матрицы:
при участии сигма фактора (у E.coli) РНК полимераза связывается с ДНК и расплетает ДНК в точке инициации транскрипции
Второй этап – инициация:
сигма фактор отсоединился и синтезирована короткая цепь РНК (2-9 пар оснований)
Третий этап – элонгация:
движение РНК полимеразы вдоль ДНК, расплетание ДНК, синтез РНК, заплетание ДНК
Третий этап –терминация:
окончание транскрипции, распад комплекса ДНК-РНК-полимераза. происходит после распознавания терминатора
ГЕНОМ E.coli - 4*1060 пар оснований
Как осуществляется распознавание точки инициации транскрипции ???
Точное распознавание точки инициации транскрипции обеспечивается благодаря существованию в каждом гене промотора.
Промотор – участок, прилегающий к старту транскрипции. Содержит регуляторные элементы, которые опознаются с белками, обеспечивающими инициацию транскрипции.
У E.coli роль таких белков выполняет сигма фактор.
В дальнейшем мы будем использовать два понятия:
Коровый промотор – участок приблизительно –40 +50
Промоторный район – 5’ фланкирующий район вплоть до старта транскрипции.
-Анализ последовательностей более 100 различных промоторов E.coli выявил сходное строение:
1) в районе старта транскрипции – пурины, часто «САТ»
2) в позиции «-10» гексамер TATAAT (последовательность «–10»)
3) в позиции «-35» гексамер TTGACA (последовательность «–35»)
4) расстояние между последовательностями «-35» и «-10» ~16-18 нуклеотидов
Функцию участков промотора изучали с помощью мутаций
нарушение последовательности - 35 замедляет посадку полимеразы на ДНК
нарушение последовательности -10 замедляет образование открытого комплекса.
Структура нескольких прокариотических промоторов. Во многих случаях реальная последовательность в позиции –10
отличается от консенсуса.
Комплекс сигма фактор – РНК полимераза (E.coli) имеет субъединичный состав. РНК полимераза E.coli включает четыре субъединицы: 2 альфа, бета и бета'. Они выполняют разные функции.
E.coli имеет несколько сигма факторов , специфичных для различных ситуаций, которые распознают промоторы разных групп генов
Располагая этими данными, и анализируя промотор с неизвестной функцией, можно предсказать, какой сигма фактор будет с ним взаимодействовать. Следовательно, можно предвидеть ситуацию, в которой будет экспрессироваться ген.
Процесс транскрипции у эукариот. Его особенности:
1) У эукариот - три типа РНК полимераз и три группы генов:
- pol I транскрибируемые -рибосомные РНК
- pol II транскрибируемые - матричные РНК
- pol III транскрибируемые – транспортные РНК
2) Каждая полимераза имеет много субъединиц, например, pol II включает более 10 субъединиц
3) Для точной посадки полимеразы на участок, прилежащий к старту транскрипции нужны вспомогательные белки – базальные транскрипционные факторы
4) промоторы генов, транскрибируемых каждым типом полимераз имеют характерное строение
В дальнейшем речь пойдет о транскрипции с участием РНК полимеразы II. С ее участием экспрессируется наибольшее количество генов.
Наблюдается огромное разнообразие в строении регуляторных районов генов этой группы. Регуляторные районы включают :
1) коровый промотор - короткий участок ДНК (~60 пар оснований), расположенный непосредственно перед стартом транскрипции и, как правило, содержащий TATA-бокс, а также Inr-элемент
2) промоторный район – 5’ регуляторный район, непосредственно примыкающий к старту транскрипции и включающий коровый промотор
2) отдаленные регуляторные районы энхансеры, сайленсеры. Могут быть удалены на большое расстояние , до нескольких тысяч пар оснований и располагаться в 5’, 3’ участках генов, экзонах и интронах.
Функция корового промотора формирование на нем преинициационного комплекса (= базального транскрипционного комплекса), включающего базальные транскрипционные факторы и полимеразу.
Функция отдаленных регуляторных районов - взаимодействие с белками, транскрипционными факторами.
Белки, контролирующие транскрипцию относятся к следующим группам:
1) Базальные транскрипционные факторы
= general transcription factors (GTFs);
2) Коактиваторы и корепрессоры;
3) Транскрипционные факторы
Характеристика базальных транскрипционных факторов (БТФ). В их число входят TFIID, TFIIB, TFIIA, TFIIH, TFIIF, TFIIE. РНК полимеразу II тоже причисляют к базальным транскрипционным факторам. Большинство БТФ имеют сложный субъединичный состав.
Ключевую роль играет фактор TFIID, включающий TBP (TATA binding protein). Согласно сложившемуся представлению, TBP опознает ТАТА бокс и служит центром сборки преинициационного комплекса (ПИК).
Основная функция TFIIB, TFIIA – стабилизация комплекса ПИК. TFIIH обладает ферментативными активностями (АТФ зависимая ДНК геликаза, ДНК зависимая АТФаза). Фактор TFIIF усиливает взаимодействие PolI с ДНК, стимулирует элонгацию.
В состав базального транскрипционного фактора TFIID входит TBP (TATA связывающий белок ). При взаимодействии с белком TBP ДНК изгибается
Существует как минимум две модели формирования преинициационного комплекса
Первая модель - пошаговой сборки. На первом этапе базальный транскрипционный фактор TFIID связывается с коровым промотором. Вслед за этим осуществляется последовательная посадка других базальных транскрипционных факторов (TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH)
Вторая модель - инициация транскрипции при участии холоэнзима, включающего РНК полимеразу II. Помимо РНК полимеразы II холоэнзим содержит базальные транскрипционные факторы. Другие (не базальные ) транскрипционные факторы, которые взаимодействуют с удаленными регуляторными районами гена, стабилизируют преинициационный комплекс. Это оказывается возможным благодаря изгибанию ДНК.
На слайде представлены типичные элементы, которые могут быть обнаружены в пределах корового промотора Pol II транскрибируемых генов. Это ТАТА бокс, инициаторный элемент (Inr), так назваемый TFIIB распознающий элемент (TFIIB recognition element) и регуляторный элемент, располагающийся ниже старта транскрипции (Downstream core promoter element). Последний впервые был обнаружен у дрозофил и чаще всего обнаруживается именно у этих организмов. На нижней части слайда указаны области контакта белков с ДНК.
Не все промоторы имеют ярко выраженные элементы этих типов.
В природе встречаются все четыре варианта строения корового промотора выделенные по признаку наличия или отсутствия ТАТА бокса и Inr элемента:
1) индивидуальные : ТАТА+ Inr-; и ТАТА- Inr+;
2) композиционные: ТАТА+ Inr+;
3) нулевые: ТАТА- Inr-;
Композиционные коровые промоторы характерны преимущественно для вирусных генов. Коровые промоторы типа TATA+Inr- встречаются чаще, чем TATA-Inr+, которые характерны для генов гематопоэа, а также гометических генов дрозофилы и млекопитающих. TATA-Inr- промоторы встречаются среди генов "домашнего хозяйства", хотя их функциональное распределение недостаточно изучено.
На слайде представлена модель регуляции транскрипции эукариотического гена. Помимо базального транскрипционного комплекса в регуляции транскрипции принимают участие белки, специфически связывшиеся с участками ДНК в различных районах гена. 5’ фланкирующем районе, 3’ фланкирующем районе, интронах и экзонах.
Регуляторные единицы , включающие сайты связывания транскрипционных факторов могут быть нескольких типов: промоторный район, энхансеры сайленсеры.
Основные понятия:
Регуляторные единицы - промоторный район, энхансеры, сайленсеры -
Регуляторные единицы – включают сайты связывания транскрипционных факторов.
Транскрипционные факторы – белки, специфически связывающиеся с ДНК и регулирующий транскрипцию.
Коактиваторы и корепрессоры, медиаторы – белки, не взаимодействующие с ДНК. Они также регулируют транскрипцию, опосредуя влияние транскрипционных факторов
В качестве примера приведена структура медиаторного комплекса SRB
у дрожжей. Это сложный мультибелковый комплекс. Влияние SRB на РНК полимеразу II опосредуется через ее карбокситерминальный домен.
Еще пример - коактиваторный комплекс ARC/DRIP млекопитающих. Он включает субъединицу – CRSP, опосредующую активацию транскрипционным фактором SP1 не зависимо от ARC/DRIP.
CBP (CREB binding protein) способен взаимодействовать с коактиваторным комплексом ARC/DRIP
Регуляторные районы генов могут иметь сложное строение и включать сайты связывания различных транскрипционных факторов. В качестве примера приведены регуляторные районы , контролирующие транскрипцию гена аполипопротеина В человека. Апо В имеет восемь регуляторных единицах. Пять регуляторных единиц располагаются в 5’фланкирующем районе: промотор (-128/-1), два негативных регуляторных элемента (-3678/-1802 и –261/-129), регуляторный район (-898/-262), а также кишечно-специфический энхансер (intestine specific enhancer) длиной 300 п.о в далекой 5’области гена (-57000 п.о). Три регуляторные единицы расположены ниже старта транскрипции: регуляторный район а первом экзоне (+1/+128), печень-специфический энхансер (liver-specific enhancer) в первом интроне (+346/+521) и liver and intestine specific enhancer во втором интроне (+621/+1064). Регуляторные единицы гена апоВ включают 21 сайт связывания транскрипционных факторов.
Еще один пример строения регуляторных районов – ген аполипопротеина (А) человека. Ген включает пять регуляторных единиц. Две регуляторные единицы расположены на участках, примыкающих к старту транскрипции (ST): промоторный район (-1259 to –1) и регуляторный район в экзоне 1 (+1/+191). Три регуляторные единицы - enhancer from 2.0-kb fragment, enhancer from 1.8-kb fragment и negative regulatory element расположены в 5’фланкирующем районе на расстоянии ~26, ~19 и ~18.5 kilobases от старта транскрипции. Регуляторные единицы гена apo(a) включают 10 сайтов связывания хорошо известных транскрипционных факторов
Еще один пример сложного строения регуляторных районов - ген ароматазы человека. Ген имеет несколько стартов транскрипции. Промоторы, обеспечивающие инициацию транскрипции имеют различное строение и включают сайты связывания различных транскрипционных факторов. Промоторы функционируют в разных типах клеток и опосредуют индукцию различными индукторами.
В основе функционирования транскрипционных факторов лежит способность этих белков к специфическим взаимодействиям с ДНК промоторов, энхансеров и других регуляторных элементов генов, а также к белок-белковым взаимодействиям с другими транскрипционными факторами и белками эукариотической клетки. Транскрипционные факторы имеют разнообразную структуру. Некоторые типы структур приведены на слайде.
Каждый транскрипционный фактор уникален по своему строению . Из этого положения следует , что для каждого фактора характерен свой набор сайтов связывания на ДНК, с которым он способен специфически взаимодействовать. На слайде приведены наборы сайтов связывания двух транскрипционных факторов – SF1 и SREBP1. В результате выравнивания сайтов связывания одного фактора можно получить так называемый консенсус сайта – последовательность в среднем похожую на каждый сайт в отдельности.
Известно множество различных транскрипционных факторов. У человека их около 2000.
Транскрипционные факторы можно расклассифицировать по функциям.
I Присутствуют в клетке постоянно
II. Экспрессируются при определенных условиях
1) Экспрессируются в развитии в определенных клетках (GATA, HNF, Pit1, MyoD)
2) Экспрессия зависит от сигнала
а) Стероидные рецепторы GR, ER, PR, TR, RARs, RXR, PPAR
б) Активируются внутренними сигналами (SREBP, p53 …)
в) Активируются сигналами, передаваемыми от мембраны клетки: (SRF, CREB, FOS-JUN, STAT, NF-kB, NFAT)
Сложное строение регуляторных районов генов и многообразие сочетаний сайтов различных типов обеспечивает большое разнообразие вариантов регуляции экспрессии генов. Еще одним дополнительным механизмом регуляции экспрессии генов является регуляция активности транскрипционных факторов. На слайде представлены семь возможных механизмов регуляции активности транскрипционных факторов.
ПРИМЕР: холестерин регулирует активность транскрипционного фактора SREBP.
Этот фактор присутствует в клетке в форме неактивного предшественника preSREBP. PreSREBP связан с мембранами эндоплазматического ретикулума. На слайде представлен гипотетический механизм активации PreSREBP. Стерол-регулируемая протеаза (SRP) расщепляет PreSREBP, в участке «1». Затем другая протеаза расщепляет белок в участке «2» и активный SREBP высвобождается и проникает в ядро. Происходит димеризация фактора , а затем ативация транскрипции целого ряда генов, содержащих в регуляторных районах сайты связывания фактора SREBP.
Высокий уровень холестерина ингибирует активность стерол-регулируемой протеазы. Таким образом реализуется механизм отрицательной обратной связи, обеспечивающий постоянный уровень холестерина в клетке.
У эукариот ДНК хранится в ядре в комплексе с белками, образуя компактную структуру – хроматин. Хроматин имеет несколько уровней органицации.
1) Нуклеосомы - комплекс ДНК с гистоновыми белками
2) 30-нм фибриллы
3) петли длиной 300 нм
4) фибрилы толщиной 250 нм
5) хроматиды в хромосоме
Нуклеосомная укладка влияет на интенсивность экспрессии. Как ???
Гистоновые белки, которые обеспечивают компактную укладку ДНК, препятствуют (затрудняют) взаимодействие транскрипционных факторов и белков базального транскрипционного комплекса с ДНК
Транскрипционные факторы делятся на две группы по способности связываться с ДНК-сайтами в составе нуклеосомы:
- обладающие такой способностью
- не способных к этому
ПРИМЕР: промотор гена MMTV (Mouse mammary tumor virus)
Экспрессия этого гена регулируется транскрипционными факторами, способными взаимодействовать ДНК-сайтами в составе нуклеосомы. И более того, наибольшая активация транскрипции возможна только в случае, если ДНК изогнута на поверхности нуклеосомы.
Если нуклеосомная укладка отсутствует, два транскрипционных фактора GR и NF1 конкурируют друг с другом за связывание с близко расположенными сайтами их связывания на ДНК.
Если нуклеосомная укладка имеет место, GR и NF1 одновременно связываются с ДНК, что способствует наибольшей активации транскрипции
Следующий механизм регуляции транскрипции – ацетилирование гистонов. Гистоновые белки имеют положительно заряженные концевые фрагменты, которые могут взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатами сахарофорсфатного остова ДНК. Это взаимодействие стабилизирует комплекс ДНК с белками.
Ацетилирование (присоединение ацетильной группы СО3СО) концевых фрагментов гистоновых белков нейтрализует их положительный заряд. Как следствие, электростатическое взаимодействие белков с ДНК ослабляется. Появляется возможность взаимодействия ДНК с некоторыми транскрипционным факторами.
Транскрипционные факторы участвуют в регуляции уровня ацетилирования гистонов. На слайде представлен такой механизм на примере гетеродимерного транскрипционного фактора RAR/RXR. Механизмом активации этого транскрипционного фактора является связывание с лигандом (см. слайд 19)
В отсутствии лиганда гетеродимерный фактор RAR/RXR связывается с ДНК а также белками корепрессорами (mSin3A, SMRT, HDAC-1). Корепрессоры осуществляют деацетилирование гистоновых белков, входящих в состав нуклеосом. Прочное связывание ДНК с нуклеосомными белками препятствует формированию базального транскрипционного комплекса в районе старта транскрипции. Совсем другая картина наблюдается в случае, если рецепторы ретиноевой кислоты связаны с лигандом. При этом транскрипционные-факторы связываются с другими белками – коактиваторами (CBP/p300, p/CAF, SRC/ACTR). Коактиваторы осуществляют ацетилирование гистонов. При этом связь ДНК с нуклеосомными белками ослабляется , что облегчает формирование базального транскрипционного комплекса в районе корового промотора. В результате наблюдается повышение уровня транскрипции гена.
Следующий механизм регуляции транскрипции – метилирование ДНК.
В эукариотических клетках уровень метилирования ДНК часто коррелирует с уровнем экспрессии гена. Метилированные участки ДНК транскрибируются менее активно, чем неметилированные участки
Наиболее часто метилированию подвергаются цитозиновые нуклеотиды, стоящие после гуаниновых
Пример: Ген проэнкефалина человека содержит сайт связывания транскрипционного фактора AP-2 районе -80/-70 от старта транскрипции. В случае, если сайт находится в деметилированном состоянии, AP-2 эффективно взаимодействует с этим сайтом, что приводит к активации транскрипции гена. Метилирование нарушает связывание AP-2 с ДНК и транскрипция снижается.
Следующий механизм регуляции транскрипции – наличие локус-контролирующих районов
Локус-контролирующий район (LCR) -удаленный регуляторный район, обеспечивающий включение и выключение генов за счет поперемнного взаимодействия с регуляторными районами генов, находящихся в кластере
Пример: локус-контролирующий район кластера гемоглобиновых генов человека.
Размер бета-глобинового кластера человека составляет 70 килобаз. Кластер содержит гены гемоглобинов G A 1 и псевдоген 1.
Экспресcия гемоглобинов осуществляется на ранних этапах онтогенеза в пренатальный период в желточном мешке, а затем в эмбриональной печени, в постнатальный период в костном мозге. При этом LCR последовательно активирует гены, входящие в состав кластера. В желточном мешке экспрессируется ген , В эмбриональной печени экспрессируются гемоглобины G и A, а в постнатальный период в костном мозге идет экспрессия гемоглобинов . Последовательное включение новых генов происходит при одновременной инактивации - и генов на соответствующих стадиях развития.
Следующий механизм регуляции транскрипции – наличие инсуляторов.
Инсулятор – участок ДНК, который, будучи помещенным между двумя регуляторными элементами может препятствовать активирующему либо подавляющему действию одного элемента на другой.
Роль инсулятора может выполнять участок прикрепления к ядерному матриксу (MAR =matrix attachment regions). При включении такого инсулятора между энхансером и промотором (см.слайд) два регуляторных района оказываются в различных доменах, и не способны взаимодействовать.
Модель сборки комплекса хроматин-модифицирующих и базальных факторов на промоторе интерферона бета человека.
Интерферон бета обеспечивает противовирусную защиту и активно экспрессируется в ответ на вирусную инфекцию.
Показано, что в непосредственной близости от старта транскрипции позиционировано две нуклеосомы. Они включают участки ДНК –268/-118 и –15/+132. В неиндуцированном состоянии связь ДНК с гистоновыми белками препятствует посадке белков базального транскрипционного комплекса. Вирусная инфекция активирует транскрипционные факторы ATF2, NF-KB, IRF1, которые вместе с HMGI(Y) формируют комплекс в районе энхансера – энхансосому. На ее поверхности происходит дальнейшая сборка активаторного комплекса, включающего хроматин-модифицирующие активности. В результате последовательно присоединения все новых комплексов белков формируется активный комплекс, который ослабляет связь ДНК с гистоновыми белками. Обеспечивается возможность инициации транскрипции РНК полимеразой II
Смотрите также: